Хлорофилл

Хлорофилл (греческий, листозелень), зеленый пигмент листьев у всех растений. В клетке мы его находим в форме чечевицеобразных телец — хлорофилловых зерен, погруженных в постенный слой протоплазмы (см. хроматофоры). Спирт и другие органические растворители — эфир, ацетон — извлекают пигменты хлорофиллового зерна; остается неизменная по величине и форме основа, или строма, состоящая из белковых веществ. У некоторых растений цвет хлорофилловых зерен может быть замаскирован или пигментами, растворенными в клеточном соку (листья колеуса, бегонии, кровяного бука), или добавочными пигментами, находящимися в хроматофорах (бурые и багряные водоросли). Так как способность растения вырабатывать самостоятельно всю свою органическую массу из углекислоты и воды насчет солнечного света присуща только тем растениям, в листьях которых находится хлорофилл, то хлорофиллу придают первенствующее значение в процессе фотосинтеза (см.). Буссенго непосредственно показал, что в этиолированных листьях, выросших в темноте и не содержащих еще хлорофилл, ассимиляцию удается обнаружить только после того, как в них появится хлорофилл, — листья на свету позеленеют. Фотосинтез рассматривают как функцию хлорофилла. Поэтому исследование хлорофилла всегда влекло к себе выдающихся физиологов, химиков, агрономов.

Исследование химической природы хлорофилла представляло непреодолимые трудности: два обычные приема очистки вещества, кристаллизация и отгонка, неприменимы, так как пигмент не кристаллизуется и не возгоняется. Кроме того, он чрезвычайно нестоек. На свету, от слабых кислот, от углекислоты, даже от действия стекла он легко разрушается. Полный переворот в изучение хлорофилла внесли работы Вильштеттера, проведенные в начале XX ст. Ему удалось выделить хлорофилл в чистом виде; он разработал приемы быстрого и полного извлечения пигмента и установил целый ряд его особых свойств. Химия хлорофилла до Вильштеттера и после работ Вильштеттера принадлежит как бы различным эпохам. Еще до работ Вильштеттера было известно, что зеленый пигмент всегда сопровождается двумя желтыми. Если к спиртовой вытяжке прибавить бензина и небольшое количество воды так, чтобы спирт стал 65—70%, то в верхний, бензиновый слой переходят зеленые пигменты, а в нижний, водно-спиртовый слой — желтые (реакция Краусса). Желтые пигменты: каротин (по терминологии Вильштеттера — каротен), который тождествен с кристаллическим пигментом корня моркови, имеет формулу С₄₀Н₅₆; он относится к группе непредельных углеводородов, имеющих хромофорное ядро — фульвена, С₅H₄ = СН₂; и ксантофилл, С₄₀Н₅₆О₂, оксид каротена. Оба пигмента очень легко окисляются на воздухе, поглощая 21% и, соответственно, 36% кислорода. Были исследованы условия образования хлорофилла; изучены его оптические свойства, и была намечена, в общем, роль хлорофилла в процессе фотосинтеза. Особенно ценно было при исследовании хлорофилла применение спектроскопа, введенное Тимирязевым. Крупное значение имели также работы Шенка, Мархлевского и Ненцкого, которые показали, что основное ядро, из которого построен зеленый пигмент листьев — хлорофилл, и красный пигмент крови — гемоглобин  одинаково. Два существенные пигмента в двух царствах природы в основе имеют одно и то же замещенное пиррольное ядро (см. пиррол).

Получение хлорофилла. До Вильштеттера хлорофилл получали или простым настаиванием, или перколяцией (медленным просачиванием растворителя) сухих или свежих листьев в спирту. Но такое извлечение длительно, большая часть хлорофилл при этом разрушается. Пигменты, выделенные различными исследователями, не совпадали; терминология их чрезвычайно запутана. Вильштеттер  предлагает сохранить название хлорофилл за всей совокупностью зеленых пигментов, извлекаемых спиртом. Общее название для желтых пигментов — каротиноиды. Выделенные же химические индивидуумы зеленого пигмента Вильштеттера обозначает просто буквами, хлорофилл а и хлорофилл b.

Вильштеттер  выработал прием, который позволяет уже часа через два иметь почти чистый препарат с содержанием хлорофилла 98%, а при малых количествах исходного материала, например из 250 г свежих листьев, уже через 45 минут, и более чистый. Для получения хлорофилла можно брать как сухие, так и свежие листья. Особенно удобны сухие листья крапивы. Тонко измельченные листья (2 кило) очень плотно набивают в большую воронку для отсасывания, с плоским дном, имеющим дырочки, поверх которых кладут фильтровальную бумагу. Порошок лежит слоем сантиметра в 4. Для экстрагирования надо брать растворители, содержащие воду: лучше всего 80%-й ацетон или 90%-й метиловый спирт. 6 литров ацетона уже через полчаса, при последовательном отсасывании, нацело извлекают пигмент. В экстракт переходит большое число разных веществ; из них на хлорофилл приходится только 8—16%. Дальнейшей обработкой петролейным эфиром, ацетоном и серным эфиром удается получить почти чистый хлорофилл (98%). Он растворяется в абсолютном спирту, очень легко — в эфире, но совсем не растворяется в петролейном эфире.

Исследуя продукты распада хлорофилла от кислот и щелочей, Вильштеттер  постоянно наблюдал образование двух очень близких по составу тел — фитохлорина е и фитородина g. Это навело его на мысль о существовании двух зеленых пигментов, на что указывал еще Сорби в 1873 г. Эти два хлорофилла Вильштеттер и разделил, пользуясь их различной растворимостью: в петролейном эфире, содержащем метиловый спирт, больше растворяется хлорофилл а, а в 85%-м метиловом спирту больше растворяется хлорофилл b. Растворы хлорофилла а — синевато-зеленого оттенка, чувствительнее к кислотам, хлорофилла b — желтовато-зеленого и легче фильтруются. Отношение количеств хлорофилла а и хлорофилла b довольно постоянно в листьях разных растений и равно 2,9 (±0,6); на 3 молекулы хлорофилла а приходится 1 молекула хлорофилла b.

Количество пигментов. Обоих зеленых пигментов вместе, и хлорофилла а, и хлорофилла b, находится в сухих листьях 0,8% (0,6—1,2), в свежих листьях — 0,112 — 0,3%, что составляет на 1 кв. метр листовой поверхности 0,3—0,7 г. Количество каротиноидов в сухих листьях равняется 0,07—0,20%; на 1 кв. м листовой поверхности — 0,03—0,07 г. Отношение количества каротина к ксантофиллу равняется 0,6 (± 0,1); на одну молекулу каротина приходится 1 ½ — 2 молекулы ксантофилла. Принимая количество всех пигментов на кило сухих листьев у бука равным 8,5 г, на 115-летнее дерево бука мы получим 180 г хлорофилла; в них каротиноидов около 40 г.

Элементарный анализ обнаруживает в молекуле хлорофилла большое содержание магния — 2,7%. Магний образует комплексное соединение с двумя дополнительными связями; Вильштеттер  полагает, что он выполняет существенную роль в процессе фотосинтеза. Элементарный состав равен для хлорофилла а С₅₅Н₇₂О₅N₄Mg; для хлорофилла b — С₅₅Н₇₀О₆N₄Mg. Хлорофилл  а и b являются трехосновными кислотами, причем две карбоксильные (кислотные) группы образуют сложные эфиры с двумя спиртовыми остатками: с метиловым спиртом и с сложным спиртом —  фитолом (см.). Фитол составляет 30% от всего хлорофилла. Вильштеттер  распутал очень сложный вопрос о кристаллическом хлорофилле. Многие авторы отмечали, что они получали кристаллический хлорофилл; но повторение их опытов не всегда удавалось. В листьях некоторых растений, Heracleum, Galeopsis, Stachys, находится особый фермент, хлорофиллаз, действующий в спиртовых растворах. Под его влиянием в хлорофилле сложная группа фитола омыляется, заменяясь тем спиртом, в котором настаиваются листья, этиловым или метиловым. В листьях крапивы такого фермента нет; поэтому из крапивы и легко получать хлорофилл неизмененным (фитил-хлорофиллид).

Третья карбоксильная группа хлорофилла находится в скрытом виде, образуя внутреннее, лактамовое кольцо (см. лактамы). Итак, общая формула составляет для хлорофилла а (С₃₁Н₂₉N₃Mg) (CONH) (СООСН₃) (СООС₂₀Н₃₉) и для хлорофилла b (С₃₁Н₂₇N₃ОMg) (CONH) (СООСН₃) (СООС₂₀Н₃₉).

Вильштеттером был детально изучен ряд сложных превращений, которым подвергается хлорофилл от действия кислот и щелочей. На основании этих исследований можно было установить строение хлорофилла. От действия кислот, далее таких слабых, как углекислота, магний отщепляется нацело; он заменяется двумя водородами. Получается труднорастворимый, воскообразный феофитин а и b, в растворе — оливкового цвета; феофитин а — С₃₂Н₃₂ОN₄ (СООСН₃) (СООС₂₀Н₃₉). Отщепленный магний можно опять ввести в частицу и тем синтезировать исходное тело. Магний легко заменить другими металлами, цинком, медью; получающиеся продукты более стойки.

От действия щелочей изменения более сложны. В первую очередь происходит временный разрыв лактамового кольца; пигмент становится не зеленым, а бурым. Через некоторое время в побуревшем растворе зеленый цвет возвращается. Карбоксильная группа лактамового кольца, при восстановлении зеленого цвета, соединяется уже с другой амидной группой; такое превращение Вильштеттера называет алломеризацией. Свойства хлорофилла — способность кристаллизоваться, растворимость — совершенно при этом изменяются, но оптические свойства — цвет, спектр, остаются неизмененными. Затем от щелочей происходит омыление эфирных групп; спиртовые радикалы, метиловый и фитоловый, соединенные с карбоксильными группами, отделяются. Получаются свободные кислоты — филлины: хлорофиллины а и b, и другие, которые при отщеплении магния дают порфирины. От дальнейшего действия щелочи, при высокой температуре, отщепляются уже самые карбоксильные группы; остается бескислородный остаток — этиофиллин С₃₁Н₃₄N₄Mg, сохраняющий еще ряд признаков хлорофилла: растворимость, цвет, флуоресценцию. В состав его входят четыре пиррольные ядра, но как они связаны между собой — еще не вполне установлено.

Из всех свойств хлорофилла наиболее существенны его оптические свойства. Их изучали больше всего. Растворы зеленых компонентов хлорофилла, особенно в эфире, обладают очень сильной, красивой флуоресценцией. Растворы в отраженном свете не зеленые, а багряно-красные. Флуоресценция настолько резка, особенно если направить пучок света на очень слабый, бесцветный раствор хлорофилла в темноте, что позволяет открыть следы хлорофилла, не обнаруживаемые спектральным анализом. Исследование флуоресценции особенно привлекает внимание за последнее время, в связи с вопросом о состоянии хлорофилла в хлорофилловых зернах и с попытками привлечь флуоресценцию к объяснению превращения света при фотохимической реакции фотосинтеза. Ввиду того, что в живых хлорофилловых зернах не удавалось обнаружить флуоресценции (твердый хлорофилл не флуоресцирует), заключали, что концентрация хлорофилла в хлорофилловых зернах настолько велика, что хлорофилл в пластидах находится в твердом состоянии. Уже раньше, при изучении спектра хлорофилла, Ивановский высказал предположение, что хлорофилл в пластидах находится в твердой коллоидальной форме. Вильштеттер рядом наблюдений решительно подтверждает эти соображения. Но применение сильного ультрафиолетового света, концентрируемого с помощью кварцевых линз, позволяет обнаружить в хлорофилловых зернах слабую флуоресценцию, что допускает возможность нахождения хлорофилл растворенным в липоидах. Есть указания, что флуоресцирующие тела поглощают лучистую энергию с образованием перекисей. С этой способностью флуоресцирующих тел стоит в согласии теория ассимиляции Вильштеттера. Соединение хлорофилл с углекислотой в пластидах на свету, насчет поглощенной энергии, претерпевает перегруппировку. В результате получается уже иное соединение атомов; появляется группа перекиси формальдегида, от которой, вероятно под влиянием фермента, уже без поглощения энергии, отщепляется в две ступени кислород и формальдегид, а хлорофилл восстанавливается в прежнем виде. Отщепленный формальдегид легко конденсируется в углеводы. Хлорофилл  действует при фотосинтезе как химический сенсибилизатор.

Весьма существенно установить спектр поглощения хлорофилл, так как только лучи, поглощаемые хлорофиллом, могут вызывать фотосинтез. Разъяснению этого вопроса чрезвычайно содействовали работы К. А. Тимирязева. Сильнее всего хлорофилл поглощает красные лучи, лежащие между фраунгоферовыми линиями В и С, а затем крайние синие лучи. Кроме того, в слабых растворах заметны еще три полосы поглощения, в оранжевой, желтой и желто-зеленой части спектра. Первая полоса поглощения хлорофилл настолько характерна, что, наблюдая ее в свете планеты Марса, заключают о присутствии на Марсе зеленой растительности. Характерна для раствора хлорофилла полная прозрачность для крайних красных лучей, влево от фраунгоферовой линии В; поэтому очень крепкие растворы хлорофилла, задерживающие почти все лучи, в проходящем свете уже не зеленые, а пурпурно-красные.

Спектр листа или отдельных пластид не вполне соответствует спектру растворов: первая типичная линия хлорофилла оказывается смещенной несколько влево. Такое же смещение линии наблюдают и в коллоидальных растворах хлорофилла, получающихся при разведении спиртовых растворов водой. Это служит одним из указаний, что хлорофилл в хлорофилловых зернах находится не в виде настоящего раствора, а в коллоидальном состоянии. В пользу этого говорит еще и то, что в коллоидальном состоянии хлорофилл более стоек; между тем как в растворах на свету, в присутствии кислорода воздуха, хлорофилл, окисляясь, выцветает очень скоро, в листьях и на солнечном свету хлорофилл не изменяется. Вильштеттер  подверг специальному исследованию вопрос, изменяется ли хлорофилл на свету при ассимиляции. Оказалось, что даже при самой сильной ассимиляции, на очень сильном свету, и количество, и отношение между всеми четырьмя компонентами хлорофилла, и желтыми, и зелеными, остаются почти без изменения.

В коллоидальных растворах хлорофилл обнаруживает способность давать с углекислотой нестойкое, диссоциирующее соединение. Это поглощение углекислоты хлорофиллом не связано исключительно с коллоидальным состоянием, так как и при выпадении хлорофилла хлопьями поглощенная углекислота не выделяется. Углекислота, присоединившаяся к хлорофиллу, но потом отделяющаяся от него, вызывает сейчас же его разрушение. В коллоидальном состоянии хлорофилл не так легко разрушается. В листьях, в пластидах хлорофилл чем-то защищен от расщепления углекислотой. В спиртовых растворах хлорофилл  с углекислотой почти не реагирует. Хотя хлорофилл поглощает углекислоты и не особенно много, но если мы перечислим на молекулярные отношения, то легко обнаружить поглощение на 1 молекулу хлорофилла ¼ — 2/5 молекулы углекислоты; большее поглощение углекислоты вызывает уже разрушение хлорофилла. Вероятнее всего, углекислота не прямо присоединяется к хлорофиллу при ассимиляции, но в начале вступает в соединение с белковыми веществами в клетке, и уже это сложное соединение связывается хлорофиллом.

Образование хлорофилла в листьях идет только при наличии ряда определенных условий. Листовые зачатки в почках содержат небольшое количество хлорофилла. Если листья развиваются в темноте (кроме ростков хвойных), они остаются желтоватыми; пластиды образуются, но не зеленеют. Такие листья, как и растения, выросшие в темноте, называют этиолированными. Этиолированные листья, выставленные на свет, зеленеют, но только не при очень низкой температуре, в присутствии кислорода воздуха и при наличии в клетке питательных веществ — углеводов; при обилии азотистого питания зеленение идет интенсивнее. В этиолированных листьях, кроме небольших количеств каротина и ксантофилла, находятся желтые пигменты, извлекаемые водой. Кроме того, хлорофилл образуется только при наличии в клетке железа. Если исключить железо из питательных солей для ростков, то листья начинают вырастать совершенно белыми, хлоротическими; доставление железа уже через день сопровождается позеленением, хотя железо в состав хлорофилла не входит. Влияние железа для зеленения вероятнее всего объясняется тем, что железо входит в состав бесцветной стромы хлорофиллового зерна. Многие авторы указывали, что образованию хлорофилла предшествует появление в пластидах вещества, которое уже превращается на свету в хлорофилл. Но выделить это вещество или установить его определенные свойства до сих пор не удается.

Недоразвитие зеленого пигмента называется хлорозом. Часто хлороз бывает патологическим явлением, в результате нарушения обмена веществ, вследствие недостатка той или иной соли или вследствие нападения паразитных организмов. В некоторых случаях хлоротические растения — искусственно выведенные садовые разновидности, как пестролистные, с белыми и желтыми листьями.

Осенью опадению листьев предшествует изменение цвета листа, связанное с разрушением, в первую очередь, зеленых компонентов хлорофилла. Но у многих растений листья, опадая, остаются зелеными и, как показал Вильштеттер, они иногда и после опадения способны ассимилировать. Трудно установить, каковы причины осеннего разрушения хлорофилла. По-видимому, оказывают влияние одновременно и понижение температуры, и уменьшение количества света, и изменения, сопровождающие отток веществ из листа.

Роль хлорофилла в растении, как химического сенсибилизатора, отчетливо установлена в упомянутой схеме Вильштеттера, а указания на такое значение хлорофилла мы находим уже в работе Тимирязева 1871 г. Однако, значение хлорофилла гораздо шире. Долго оставалось загадочным, как на бесцветную углекислоту при ассимиляции могут влиять видимые лучи, углекислотой не поглощаемые. Ответ на этот вопрос был намечен Фогелем (1873) и обстоятельно разъяснен Тимирязевым. Хлорофилл  в пластидах служит не только химическим, но и оптическим сенсибилизатором. Тимирязев экспериментально доказал, что лишь лучи, поглощаемые хлорофиллом, оказываются деятельными при ассимиляции. Хлорофилл, поглощая световые лучи, передает их энергию бесцветной углекислоте. Энергия, поглощенная хлорофиллом, и идет на разложение углекислоты. Ср. фотосинтез.

Литература. К. А. Тимирязев: «Спектральный анализ хлорофилла» и др. статьи в его книге «Солнце, жизнь и хлорофилл», 1923. R. Willstätter und А. Stoll: «Untersuchungen über Chlorophyll», 1913 и «Untersuchungen über die Assimilation der Kohlensäure», 1918. Курсы по физиологии растений Ивановского или Костычева (1924). Benecke u. Jost «Pflanzenphysiologie», Bd. I, 1924. Stiles: «Photosynthesis», 1925.

Ф. Крашенинников.